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培養基的使用細節與規范化操作指南

2025-07-08 09:13:11

***、配制前的準備

  1. 配方確認與計算

  - 根據實驗目的選擇培養基類型(如營養瓊脂、LB液體、沙保弱培養基等),嚴格按照標準配方稱量成分。

  - 注意特殊成分的處理:如酵母提取物、蛋白胨需充分溶解;痕量元素(如Mg2?、Ca2?)應預先溶解后添加。

  - 計算水量時需扣除其他液體成分(如葡萄糖溶液、維生素溶液)的體積。

  2. 容器與工具準備

  - 使用玻璃或耐腐蝕塑料容器(如錐形瓶、培養皿),避免金屬器具直接接觸培養基。

  - 器皿需提前清洗并烘干,防止水分殘留導致滲透壓變化。

  - 磁力攪拌器、pH計、電子天平等設備需校準,確保測量精度。

  二、配制與滅菌

  1. 溶解與混合

  - 按配方順序依次加入成分,先加水后加耐熱物質(如瓊脂),***后添加熱敏感物質(如抗生素、血清)。

  - 加熱時持續攪拌,避免局部過熱導致焦糊或成分分解。

  - 瓊脂融化后需煮沸1-2分鐘,確保膠體均勻分布。

  2. pH調節

  - 冷卻至50-60℃時調節pH,使用精密pH計(誤差≤0.01)逐滴加入1mol/L NaOH或HCl。

  - 避免過度調節:每滴酸堿可影響pH約0.2-0.3,需緩慢調整至目標范圍(如大腸桿菌培養基pH 7.0±0.2)。

  - 高溫下pH會因蒸發而升高,需預留0.1-0.2的補償值。

  3. 滅菌操作

  - 高壓蒸汽滅菌:液體培養基121℃、15分鐘;含糖培養基需115℃、20分鐘以防焦糖化。

  - 過濾除菌:適用于熱敏感成分(如胎牛血清),采用0.22μm濾膜正壓過濾。

  - 滅菌后立即搖勻并冷卻,避免沉淀凝結或污染。

  三、分裝與儲存

  1. 分裝規范

  - 固體培養基倒入培養皿時需均勻鋪展,厚度約3-5mm,避免氣泡產生。

  - 液體培養基按實驗需求分裝(如試管裝量不超過1/5體積,搖瓶裝量為1/10)。

  - 斜面培養基傾注后需靜置凝固,形成平整斜面。

  2. 儲存條件

  - 已滅菌培養基需在2周內使用,4℃冷藏時密封避光,防止水分蒸發或污染。

  - 含淀粉類成分的培養基易老化,需現配現用。

  - 添加劑(如抗生素、指示劑)宜單獨儲存,使用時按需加入。

  四、接種與培養

  1. 無菌操作

  - 接種前用75%酒精擦拭工作臺面,點燃酒精燈形成無菌區。

  - 接種環需灼燒滅菌,待冷卻后挑取菌種,避免高溫殺死目標菌。

  - 劃線法接種時注意分區分離,第三區后不再返回前區,防止交叉污染。

  2. 培養條件控制

  - 溫度:嚴格按菌種需求設定(如大腸桿菌37℃、乳酸菌30℃、嗜熱菌55℃)。

  - 氣體環境:厭氧菌需抽真空充氮或使用厭氧罐;CO?依賴菌需5%-10% CO?環境。

  - 濕度與避光:培養箱內放置水盤維持濕度,光敏感菌種需用黑袋包裹。

  五、常見問題與應對

  1. 污染控制

  - 霉菌污染:多因滅菌不干凈或操作時間過長,需延長滅菌時間或縮短接種流程。

  - 細菌污染:可能來自吸管、槍頭或空氣,需更換無菌耗材并加強超凈臺維護。

  - 支原體污染:定期檢測細胞系,使用含青霉素、支原體清除劑的培養基。

  2. 培養基異常

  - 不凝固:瓊脂濃度不足或pH過高,需補加瓊脂并重新滅菌。

  - 顏色變化:指示劑失效或成分氧化,應檢查原料有效期并避光保存。

  - 菌落形態異常:滲透壓偏差或缺乏生長因子,需復核配方并補充酵母提取物等。

  六、特殊培養基的使用要點

  1. 選擇性培養基(如麥康凱瓊脂):

  - 膽鹽、結晶紫需溶解,抑菌劑濃度需精確控制。

  - 目標菌(如大腸桿菌)應形成典型菌落,抑制雜菌生長。

  2. 鑒別培養基(如伊紅美藍瓊脂):

  - 顯色反應需在規定時間內觀察,避免過度曝光導致顏色掩蓋。

  3. 富集培養基(如GN增菌液):

  - 專性菌種優先增殖,需配合選擇性平板進行二次分離。


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